A él nos hemos referido en varias ocasiones en Provida Press (nº 181,191,199 y 207), pero nos parece que puede ser útil para nuestros lectores refundir y actualizar toda esta documentación en un único informe. El problema ético fundamental para poder utilizar células madre embrionarias humanas es que hay que destruir al embrión del cual se obtienen (Journal Clinical Investigation 114; 1184, 2004). Esto hace que cualquier experiencia que se pueda realizar con ellas merezca una valoración ética negativa. Pero como estas experiencias pueden ser, desde un punto de vista biomédico importantes, se está intentando buscar alternativas para poder disponer de dichas células sin tener que destruir los embriones humanos que las donan.

        En realidad, la única posibilidad que no tendría dificultad ética alguna para conseguir células madre embrionarias, sería que dichas células pudieran extraerse de embriones humanos generados por vía natural, pero sin tener que destruirlos. En este caso se podría tratar éticamente el tema como se trata el de la donación de órganos por parte de donante vivo, tema que, sometido a las cautelas éticas más elementales, sería moralmente aceptable. Pero esta posibilidad es técnicamente inviable.

        Desde un punto de vista experimental son varias las posibilidades que se han propuesto para conseguir células madre embrionarias sin tener que destruir a los embriones de los que se obtienen, que podrían resumirse en las siguientes: a) obtenerlas de embriones congelados, y posteriormente descongelados, sobrantes de técnicas de fecundación in vitro, a los que se considerara técnicamente muertos, pero que aun pudieran conservar células vivas útiles para experimentaciones biomédicas; b) extraerlas de un embrión en fase muy temprana de su desarrollo, menos de 16 células, lo que no requeriría la destrucción del embrión que las dona; c) crear estructuras biológicas no embrionarias, por transferencia nuclear somática, a partir de material cromosómico genéticamente modificado obtenido de células somáticas adultas, de las cuales se pudieran obtener las correspondientes células madre; d) reprogramar células somáticas adultas fusionándolas con células madre embrionarias; e) obtenerlas de embriones aneuploides y f) reprogramar directamente células somáticas adultas hasta el estado de indeferenciación genómica propia de las células embrionarias pluripotenciales, para de ellas poder obtener las correspondientes líneas celulares.

        Las cuatro primeras soluciones pueden plantear sustanciales dificultades éticas y todas ellas problemas técnicos de importancia suficiente para que realmente puedan constituir, en la actualidad, una posibilidad objetiva para obtener las correspondientes células madre. De todas formas, lo que parece indudable es que se está empezando a entreabrir una puerta para solucionar el problema de la consecución de células madres embrionarias humanas por procedimientos éticamente válidos, aunque dicha posibilidad, en cualquiera de sus variantes, hay que valorarla con todas las cautelas de una investigación biomédica incipiente.

        Antes de seguir adelante conviene sin embargo remarcar que, desde un punto de vista ético, las soluciones a), b) y d) presentan una importante dificultad moral añadida, derivada del hecho de que los embriones a utilizar, sean destruidos o no, tienen que ser generados por fecundación in vitro, técnica que en si misma conlleva objetivas dificultades morales.

        Entrando ya a analizar cada una de las seis soluciones anteriormente apuntadas, la primera era obtener las células madre embrionarias a partir de embriones descongelados muertos. Esto se puede conseguir utilizando embriones congelados sobrantes de fecundación in vitro, de los que actualmente hay más de un millón y medio en todo el mundo. En este caso se estaría ante una situación similar a la obtención de órganos de cadáveres humanos para transplantes. Sin embargo, entre ambos casos existe una diferencia técnica sustancial, cómo determinar la muerte del ser humano adulto o del embrión utilizados.

        En el primer caso, en el del ser humano adulto, se admite que la muerte del cerebro es legalmente equivalente a la muerte del individuo, por lo que cuando aquella ocurre, determinada según los procedimientos técnicos actualmente existentes para ello (Neurology; 45, 1912, 1995), se puede considerar a aquel individuo como un cadáver y por tanto podría ser un donante legal de sus órganos. Pero cuando nos referimos al embrión, establecer su muerte es más dificultoso, al no poder utilizarse el criterio neurológico, pues como es sabido, en ese momento evolutivo del embrión aún no se ha desarrollado el sistema nervioso. Por tanto, habrá que utilizar otros parámetros.

        Tratando de certificar si un embrión descongelado de 4 a 8 células, que es el momento evolutivo en el que los embriones sobrantes de fecundación in vitro suelen congelarse, está muerto, Landry y Zucker (Journal Clinical Investigation 114; 11

        4, 2004), proponen seguir los siguientes criterios: los embriones congelados que no se dividen a las 24 horas de su congelación, tras el subsiguiente caldeamiento, son desechados para fines reproductivos por considerarlos inviables. Estos embriones deberán ser observados con intervalos de pocas horas, durante las 24 siguientes. Según los autores se puede razonablemente concluir que los embriones que no se han dividido en este periodo de tiempo, ya nos se dividirán más, por lo que se les puede considerar orgánicamente muertos. Además en estos embriones se podrá determinar si expresan marcadores celulares que indiquen que se ha producido una parada del crecimiento celular. De todas formas estos marcadores de muerte celular aún no son bien conocidos, pero cuando estén bien establecidos será otra posibilidad más para determinar que un embrión está muerto. A estos embriones muertos se les podrían extraer las células hipotéticamente vivas para experimentaciones biomédicas.

        Pero, a nuestro juicio son muchas las preguntas que todavía quedan por responder antes de concluir que se ha encontrado una solución éticamente correcta, científicamente válida y socialmente adecuada, para la obtención de células madre a partir de embriones humanos muertos. Entre ellas las siguientes: a) ¿es en el momento actual científicamente posible determinar que un embrión está verdaderamente muerto, pero que conserva algunas de sus células (blastomeros) vivas?; b) ¿en caso de que así sea, existen garantías científicas de que dichas células serán realmente útiles para iniciar costosas y difíciles investigaciones biomédicas?; c) ¿aceptarán los científicos estas células para sus experiencias o darán preferencia a las generadas a partir de líneas celulares de garantía técnica reconocida?; d) otro aspecto importante a considerar es que en todas las experiencias a que nos estamos refiriendo se parte de embriones de 4 a 8 células, pues, como ya se ha comentado, este estado de división celular suelen tener los embriones sobrantes de fecundación in vitro; pero dado que es sabido que las células embrionarias útiles para obtener células madre se consiguen de la masa granulosa interna de los blastocistos, es decir cuando el embrión tiene entre 64 y 200 células aproximadamente, difícilmente puede servir las células de un embrión humano de 4 a 6 células madre, pues éstas no son adecuadas, por lo que habrá que cultivarlo hasta la fase de blastocisto, procedimiento que indudablemente conlleva la revitalización del embrión, por lo que las células embrionarias serán ineludiblemente obtenidas de un embrión vivo que hay que destruir.

        Estas y otras preguntas, son las que habrá que responder antes de proponer como éticamente correcto y científicamente válido el uso de células embrionarias humanas obtenidas de embriones muertos, para experimentaciones biomédicas.

        Pero además, en caso de que se pudieran obtener células vivas de embriones descongelados muertos, su uso aún podría presentar objetivas incertidumbres biológicas (Lancet 364; 115, 2004), al ser obtenidas a partir de embriones que, indudablemente, son de baja calidad, pues no hay que olvidar que los embriones que se congelan son los desechados tras la primera tentativa de implantación. Por ello, no se puede asegurar que estas células tengan la misma calidad que tienen las obtenidas a partir de embriones frescos, por lo que no se sabe si los investigadores que trabajan en este campo estarían dispuestos a iniciar costosas y difíciles experiencias biomédicas a partir de un material celular de dudosa calidad, cuando hoy día pueden adquirir en el mercado líneas celulares de absoluta garantía. En este sentido, uno de los miembros del Consejo de Bioética que asesora al Gobierno norteamericano, la doctora Janet D Rowley, manifestaba recientemente grandes dudas sobre la posibilidad de utilizar células madre embrionarias obtenidas a partir de embriones muertos, y en la misma dirección, un investigador español que trabaja en este campo, el doctor Carlos Simón (Provida Press nº 191, www.provida.es/valencia), manifestaba recientemente que no entendía que se utilicen embriones muertos de los que sobran de la fecundación in vitro, cuando se pueden usar embriones frescos generados por esta misma técnica, con el dato adicional de que los donantes puedan ser seleccionados entre los más válidos.

        Una última dificultad, es que la eficiencia de esta técnica es muy baja, pues solamente un 3% de los embriones descongelados parece que pueden ser útiles para investigaciones biomédicas (Lancet 364; 115, 2004). Por ello, si actualmente se utilizaran todos los embriones congelados existentes en Estados Unidos, solamente se podrían conseguir 275 líneas celulares, número absolutamente insuficiente para las demandas de investigación de ese país.

        Todo lo anterior parece indicar que el uso de embriones descongelados muertos no es una posibilidad adecuada para obtener células madre embrionarias.

        La segunda posibilidad es obtenerlas de embriones de menos de 16 células, generados por fecundación in vitro, ya que en este caso las células madre se podrían conseguir sin tener que destruir al embrión que las dona, ya que estos embriones, después de extraerles la célula a partir de la cual se pueden derivar las células madre, podrían ser implantados. Esto ha sido conseguido por un equipo de investigadores del Instituto de Genética Reproductiva de Chicago, dirigido por el Dr. Verlinsky (Reproductive BioMedicine Online; htp:// www.rbmonline.com/Article 1558). Para ello, los autores extraen un blastómero (una célula que aún es totipotente) de un embrión de 4 días, es decir, de un embrión de 60 a 70 células, generado por fecundación in vitro, es decir de un embrión en fase de mórula, por lo que, en la mayor parte de las veces, la extracción de esta célula no conlleva la destrucción del embrión. Por tanto, las células se obtienen uno o dos días antes de que se constituya el blastocisto, embrión de 64 a 200 células, que es del que habitualmente se extraen las células para, tras cultivarlas, conseguir las células madre embrionarias. A partir de la célula así obtenida se pueden desarrollar las líneas celulares que se desean.

        Si estas experiencias se confirmaran, y parece que existe una gran probabilidad de que así sea, se podrían obtener células madre embrionarias sin tener que destruir al embrión que las dona, por lo que se evitaría la principal dificultad ética para obtenerlas.

        Pero esta técnica tiene, además de la ya comentada dificultad moral de que los embriones deben ser generados por fecundación in vitro, la dificultad humana de que es muy improbable que un a pareja que tenga problemas de infertilidad y que desee tener un hijo, por lo que acude a la fecundación in vitro, acceda a que el embrión generado sea manipulado, con los riesgos que esto presupone para dicho embrión. Por tanto, no parece que esta posibilidad, por el momento, sea factible. Además, el uso de las células así obtenidas, por proceder de otro individuo distinto al que se le va a practicar el trasplante celular, conllevaría, sin duda, problemas de rechazo similarmente a lo que ocurre con los trasplantes en los que un paciente recibe el órgano de otra persona distinta.

        La tercera posibilidad, es conseguirlas a partir de estructuras biológicas no embrionarias, como pueden ser los cuerpos embrioides, que como se sabe son agregados de células embrionarias que pueden reproducir muchos de los procesos que ocurren en las primeras etapas del desarrollo embrionario (Blood 106; 150, 2005), creadas por transferencia nuclear somática alterada (ANT).

        En efecto, parece que se puede abrir una nueva posibilidad de generar entidades biológicas no embrionarias que podrían servir como fuente de células madre por el sistema denominado ANT, propuesto por William B Hurlbut, de la Universidad de Stanford, en California. Según comenta Maureen L Condic (First Things 155; 12, 2005), esta metódica conlleva tres etapas, en la primera se toma una célula somática adulta del paciente que requiere el trasplante celular y se altera su ADN cromosómico para dirigir la expresión genética del núcleo hacia un objetivo biológico determinado, que en este caso, tiene como finalidad que el embrión creado no sea viable. Después, este núcleo alterado se fusiona con un ovocito enucleado, lo que da lugar a una nueva célula distinta del ovocito originario y de la célula adulta alterada, es decir, se produce un híbrido que exhibe las propiedades génicas programadas en el núcleo alterado en la célula somática adulta. Finalmente, la célula ANT, tras estimularla adecuadamente, puede desarrollarse hasta dar lugar a un blastocisto alterado que es incapaz de implantarse y del cual se podrían extraer las células madre que serían genéticamente idénticas a las del paciente del que se tomó la célula original, células que podrían usarse, tanto para investigaciones biomédicas en general, como terapéuticamente para tratar al paciente que donó la célula somática adulta.

        Recientemente, la metódica ANT ha sido utilizado por A Meissner y R Jaenisch (Nature, 16 de octubre, 2005), este último, como se sabe, uno de los máximos expertos actuales en técnicas de clonación y experimentación con células madre. Pues bien, Meissener y Jaenisch proponen crear, utilizando ratones, blastocistos alterados a partir de un tipo de células somáticas adultas, los fibroblastos, cuyo material cromosómico se ha modificado para que no puedan expresar un gen el Cdx2, necesario para que el blastocisto pueda implantarse. Así pues, estos embriones serían prácticamente inviables al carecer de un trofoblasto funcionalmente activo, por lo que no podrían implantarse en el útero. Sin embargo, si que podrían ser fuente de células madre embrionarias pluripotenciales. Sin embargo, el método ANT, además de tener todavía importantes incertidumbres biológicas, tiene también concretas objeciones morales. En efecto, aunque la entidad biológica generada puede producir un blastocisto alterado incapaz de implantarse en el útero, por el momento no es posible descartar que este ente embrionario en alguna etapa de su desarrollo no haya tenido las características de un embrión vivo, circunstancia ésta que por el momento es experimentalmente imposible de comprobar. En efecto, una cosa es que en un ser humano vivo no pueda implantarse y otra que previamente a la implantación no haya tenido en ningún momento el carácter biológico de embrión humano. Esta duda biológica hace que por el momento la ANT muestre también razonables objeciones éticas.

        La cuarta posibilidad que ahora se acaba de abrir para obtener células madre embrionarias, es conseguirlas a partir de células madre de tejidos adultos que tras fusionarse con células madre embrionarias, pueden llevarse a un estado de indeferenciación genómica similar al embrionario.

        En relación con ello, conviene recordar que para que la transferencia nuclear somática (clonación terapéutica), pueda utilizarse para la obtención de células madre embrionarias, el núcleo de la célula somática, antes de ser transferido al ovocito, debe reprogramarse hasta un estado cromosómico más indiferenciado, parecido al embrionario. Los mecanismos que rigen este proceso son todavía poco conocidos, pero se sabe que cuando el núcleo de la célula somática se inyecta en el óvulo enucleado, el citoplasma de dicho óvulo tiene capacidad para reprogramar el material cromosómica de la célula adulta (Nature 415; 1035, 2002), dando lugar a una célula con un estado de indiferenciación similar al de las células embrionarias pluripotentes, y con una estructura cromosómica similar a la de la célula somática que ha donado el núcleo. Además, como la estructura génica del núcleo de estas células, es prácticamente idéntica a la del donante, si dichas células son trasplantadas a éste, no sufrirán rechazo, por lo que podrían ser utilizadas para terapia celular. Esto es lo conseguido recientemente por W S Hwang (Science 308, 1777, 2005) al crear 11 líneas celulares a partir del material genético obtenido de células somáticas adultas de otros tantos pacientes.

        Para poder obtener las mencionadas células embrionarias, posteriormente el cigoto generado hay que desarrollarlo hasta blastocisto, del cual se obtienen las células madre, que tras cultivarlas adecuadamente podrían ser útiles para investigaciones biomédicas, y para tratar enfermedades tan importantes como el Parkinson, Alzeheimer o diabetes de tipo 1.

        Pues bien, una posibilidad de obtener células pluripotentes de tipo embrionario sin necesidad de tener que utilizar ovocitos humanos para que las células adultas se reprogramen a células pluripotentes, es la propuesta por Cowan y col (Science 309; 1369, 2005), quienes sugieren y después confirman, que si las células somáticas adultas se fusionan con células madre embrionarias, estas pueden ejercer un papel similar al que desarrolla el citoplasma del ovocito para conseguir la reprogramación del material cromosómico de las células somáticas adultas a células indiferenciadas de tipo pluripotente. Para conseguir esto, los autores, fusionan fibroblastos, un tipo de célula somática adulta, con células madre embrionarias, tras cultivar ambos tipos de células en un medio que facilita la fusión de sus membranas obtienen un híbrido dotado de un único núcleo. Pero como esta nueva célula procede de dos células, fibroblasto y célula madre embrionaria, con un núcleo diploide, la célula resultante tendrá el doble de dotación cromosómica de las células adultas normales, es decir, será una célula tetraploide con 92 cromosomas.

        Las células tetraploides así obtenidas se comportan de forma muy similar a como lo hacen las células madre embrionarias pues tienen marcadores protéicos propios de dichas células; ofrecen el mismo carácter de "inmortalidad" (de hecho, en estas experiencias concretas, las células sufrieron más de 50 pases de cultivo); pueden diferenciarse en cuerpos embrioides, como hacen las células madre embrionarias y también desarrollar teratomas, pudiendo ambos, teratomas y cuerpos embrioides expresar actividad de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Es decir, parece que las células madre embrionarias humanas, cuando se fusionan con células somáticas adultas, asimismo humanas, pueden reprogramar el núcleo de estas últimas, para transformarlas en células pluripotentes similares a las embrionarias, lo que ya se había conseguido experimentalmente utilizando ratones (Current Biology 11; 1553, 2001).

        Los resultados aquí comentados sugieren que las células madre embrionarias probablemente contienen los factores de reprogramación nuclear necesarios para modificar el núcleo de las células somáticas adultas llevándolas a un estado de pluripotencialidad (Cell, DOUI 10.1016/j:cell.2005.08.023), por lo que podrían sustituir a las células madre embrionarias obtenidas de blastocistos generados por fecundación in vitro o por transferencia nuclear somática. Incluso, según M Azim Surani comenta en el mismo artículo de Cell anteriormente referido, es posible que las células madre embrionarias sean incluso más eficientes para reprogramar el material cromosómico de las células somáticas adultas que el propio citoplasma de los ovocitos.

        Pero a pesar de estas esperanzadoras posibilidades, uno de los autores del grupo de Cowan, también firmante del trabajo, Kevin Eggan, según recoge un reciente editorial de la prestigiosa revista médica New England Journal of Medicine (353; 1646, 2005), manifiesta que ellos aún no han podido poner a punto una metodología para generar células que puedan reemplazar a las células madre embrionarias, aunque sin duda, dichos estudios, pueden ser la base para futuras experiencias que permitan ir conociendo mejor los complicados mecanismos de la reprogramación cromosómica de las células somáticas adultas.

        Sin embargo, un aspecto negativo de estas experiencias es que los híbridos así generados, al ser tetraploides su potencial terapéutico es prácticamente nulo, por lo que podrían utilizarse para experiencias biomédicas, pero no para terapia celular. Por ello, como comentan los propios autores (Science 309; 1369, 2005), y también recoge un editorial de JAMA del pasado mes de octubre (294; 1475, 2005), para hacer terapéuticamente útiles estas técnicas habría que desarrollar un método para eliminar el ADN sobrante, que proporciona la célula madre embrionaria, para así convertir la célula tetraploide obtenida en diploide, circunstancia, que como el propio Eggan reconoce, por el momento parece técnicamente muy difícil de conseguir.

        Además, de las incertidumbres técnicas biológicas aquí comentadas, desde un punto de vista ético, dado que para la obtención de este tipo de células tetraploides, hay que utilizar células madre embrionarias, que se obtienen de embriones humanos que hay que destruir, tampoco se habría resuelto la dificultad ética que la utilización de células embrionarias tiene, esencialmente debido que para obtenerlas hay que destruir al embrión que las dona. De todas formas, conviene recordar que, según comenta B M Kuehn, en el editoral de JAMA anteriormente referido, lo que en realidad preocupa a los autores que proponen esta técnica, no es que haya que destruir embriones humanos, para obtener células madre embrionarias, sino la dificultad de conseguir los ovocitos humanos necesarios para llevar a cabo la transferencia nuclear somática, por lo que estos ovocitos pueden ser sustituidos por embriones humanos fácilmente conseguibles en los bancos de embriones congelados sobrantes de fecundación in vitro.

        La quinta posibilidad es obtener las células madre de cigotos aneuploides. Como se sabe, los cigotos normales tienen dos pronúcleos, uno procedente del padre y otro de la madre. Sin embargo, tras la fecundación in vitro se pueden obtener cigotos que tienen uno o tres pronúcleos, a estos cigotos se les denomina aneuploides y son inviables. Recientemente, se ha comprobado que de blastocistos de embriones aneuploides se pueden obtener células madre de tipo embrionario que son normales (Human Reproduction 19; 670, 2004). En la experiencia concreta que se describe en el artículo de Human Reproduction, los autores utilizan 9 blastocistos obtenidos de cigotos aneuploides, de los cuales se pudo obtener una línea de células madre embrionarias. Si estas experiencias se confirmaran se tendría otra posibilidad más de conseguir células madre embrionarias sin tener que destruir un embrión viable. De todas formas la valoración ética positiva de esta técnica hay que realizarla con prudencia, pues con anterioridad ha sido demostrado (Human Reproduction 10; 132, 1995 y 12; 321, 1997) que tras la fecundación de ovocitos por inyección intracitoplasmática de espermatozoides, entre un 10% y un 30% de los cigotos aneuploides obtenidos pueden generar blastocistos normales, que por tanto podrían dar lugar a embriones asimismo normales.

        A nuestro juicio, la única posibilidad real para conseguir células similares a las embrionarias, sin tener que destruir un embrión humano, sería poder desdiferenciar (rejuvenecer) células madre de tejidos adultos de la persona que debe recibir el trasplante celular, para así, tras reprogramar su genoma, obtener de las células generadas, las correspondientes líneas celulares.

        Por el momento este método no parece técnicamente posible. Sin embargo, según comenta ML Condic (First Things 155; 12, 2005) un nuevo camino se ha abierto para conseguir este fin con la introducción de la denominada Transferencia Nuclear Alterada- Reprogramación Asistida del Ovocito (ANT-OAR). Esta propuesta, según Condic, está siendo refrendada por un número significativo de científicos y bioéticos de prestigio en un documento denominado "Creation of Pluripotent Stem Cell by Oocyte Assisted Reprogramming".

        A diferencia de la ANT que propone suprimir del genoma de la célula adulta la información expresada por algún gen necesaria para que el embrión generado sea viable, en la ANT- OAR lo que se propone es una modificación genética del material cromosómico de la célula somática adulta para que ésta sólo se pueda desdiferenciar hasta un estadio evolutivo de célula pluripotente, pero sin llegar nunca a un estadio de célula totipotente. En este caso, a partir de la célula generada solamente se podrán derivar células de diversos tejidos pero nunca un embrión humano. De esta forma se habrían solventado las dificultades inherentes a la necesaria destrucción de un embrión para obtener células madre embrionarias.

        Para conseguir que la célula somática adulta se reprograme, en este caso se utiliza la capacidad que para ello tiene el citoplasma de los ovocitos. Así pues, al transferir el núcleo de la célula somática adulta a un ovocito enucleado, no se pretende generar una célula totipotente, aunque si estuviera modificada como la ANT no podría dar lugar a un embrión, sino únicamente reprogramar la célula somática adulta a célula pluripotente. Sin embargo, la posibilidad de poner la técnica ANT-OAR a disposición de la clínica humana, exigirá primero una amplia experimentación con células animales, para delimitar mucho mejor todo el procedimiento técnico, pero cuando la técnica ANT-OAR pueda estar disponible se tendrá la posibilidad de obtener células madre embrionarias por un método éticamente aceptable al no requerir éste la destrucción de embriones humanos.

        De todas formas, en el mundo de las cosas reales, todo el debate aquí suscitado, encaminado a obtener células madre sin tener que destruir embriones humanos parece un tanto irrelevante, pues a la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo no les preocupa cual puede ser el origen y el método para conseguir las células madre embrionarias que utilizan, sino que lo único que exigen es que éstas sean de buena calidad, y esto, de momento, lo pueden conseguir bien obteniéndolas de los bancos de embriones actualmente congelados o simplemente comprándolas a los bancos comerciales actualmente existentes.